一醋酸白试验
 
　　用3-5%醋酸外涂疣体2-5分钟病灶部位变白稍隆起肛门病损可能需要15分钟本试验的原理是蛋白质与酸凝固变白的结果HPV感染细胞产生的角蛋白与正常的未感染上皮细胞产生的不同只有前者才能被醋酸脱色醋酸白试验检测HPV的敏感性很高它比常规检测观察组织学变化还好但偶尔在上皮增厚或外伤擦破病例中出现假阳性假阳性变白迹象显得界限不清和不规则美国CDC提示醋酸白试验并不是特异试验且假阳性较常见
 
　　二免疫组织学检查
 
　　常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法（即PAP）显示湿疣内的病毒蛋白以证明疣损害中有病毒抗原HPV蛋白阳性时尖锐湿疣的浅表上皮细胞内可出现淡红色的弱阳性反应
　
　　三组织化学检查
 
　　取少量病损组织制成涂片用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色如病损中有病毒抗原则抗原抗体结合在过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）方法中核可被染成红色此法特异性强且较迅速对诊断有帮助
　
　　四病理检查
 
　　主要为角化不全棘层高度肥厚乳头瘤样增生表皮突增厚延长其增生程度可似假性上皮瘤样刺细胞和基底细胞并有相当数量的核分裂颇似癌变但细胞排列规则且增生上皮和真皮之间界限清楚其特点为粒层和刺层上部细胞有明显的空泡形成此种空泡细胞较正常大胞浆着色淡中央有大而圆深嗜碱性的核通常真皮水肿毛细血管扩张以及周围较致密的慢性炎性浸润Bushke-loewenstein巨大型尖锐湿疣表皮极度向下生长代替了其下面的组织易与鳞状细胞相混故须多次活检若有缓慢发展之倾向 则为一种低度恶变的过程即所谓疣状癌
 
　　五基因诊断
 
　　迄今HPV难于用传统的病毒培养及血清学技术检测主要实验诊断技术是核酸杂交近年来发展的PCR方法具有特异敏感简便快速等优点为HPV检测开辟了新途径
 
　　（一）标本的采集及处理
 
　　1．标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞在作细胞学检查的同时将标本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中用PBS离心（3000g10min）洗涤2次沉积细胞重悬于1mlPBS中取0.5ml细胞悬液抽提DNA
 
　　2．标本核酸的提取：按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液（10mmol/L Tris-HClpH 7.410mmol/L EDTA150mmol/L NaCl0.4%SDS1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下处理过夜;且等体积酚/氯仿(1:1)氯仿/异戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10体积3mol/L NaAc（pH 5.2）及2.5倍体积无水乙醇置-20℃ 2h或过夜沉淀DNA；加1体积乙醇洗涤1次；用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HClpH 8.01.0mmol/L EDTA)溶解DNA37℃温育30min
 
　　（二）PCR扩增
 
　　1．  引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L）每区含一系列开放读码框架（ORF）序列分析表明各型HPV的非编码区及E1E6E7和L1区均有保守序列Manos等从HPVL1区中选择保守序列设计合成引物MY11和MY09见表1该引物与HPV 6111618及33型有互补序列也可扩增其它型HPV
 
　　Manos等设计的HPVL1通用引物
 
　　MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG
 
　　MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

　　表1

HPV型
 MY11的第1个硷基位置
 MY09的第1个硷基位置
 PCR产物长度（bp）
 
6
 6722
 7170
 448
 
11
 6707
 7155
 448
 
16
 6584
 7035
 451
 
18
 6558
 7012
 454
 
33
 6539
 6987
 448
 

　　 M=A+C R=A+GW=A+TY= C+T
　　表2列述了Manos等设计的寡核苷酸探针公用混合探针序列选自HPVL1区中另一保守序列可与MY11和MY09引物产生的多种HPVL1 PCR扩增产物杂交：型特异探针只与相应HPV型有互补序列用于检出的HPV分型
　　
　　表2   Manos等设计的HPVL1 PCR产物探针公用混合探针
 
GP1   CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC
 
GP2  CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC
 
第一个硷基位置
 
HPV6   6771                  HPV11  6757                          HPV16   6631
 
HPV18  6607                  HPV33  6588
 

　　2．PCR反应试剂：Taq DNA聚合酶（2U/ml）10mmol/L dNTP贮备液（dATPdCTPdGTPdTTP各10mmol/L）10×PCR缓冲液(500mmol KCl40mmol/L MgCl2100mmol/L Tris-HClpH 8.5)100μmol/L MY11和MY09贮备液灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水
 
　　3．PCR扩增方法和程序：以100μl PCR反应液,用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应
 
　　（1）实验前配制预混反应试剂并分装预混反应试剂包括除标本DNA外的其它各种PCR反应试剂每支反应管中含有的PCR反应试剂见表3
 
　　表3    每支反应管中的PCR反应试剂

反应试剂
 体积（μl）
 终浓度
 
10×PCR缓冲液
 10
 1×PCR缓冲液
 
dNTP贮备液
 2
 200μmol/L每种dNTP
 
MY11贮备液
 0.5
 500μmol/L
 
MY09贮备液
 0.5
 500μmol/L
 
Taq DNA聚合酶
 0.5
 2.5μ
 
灭菌蒸馏水
 75.5
  
 
总计
 90.0
  
 

　　（2）各反应管依次加入10μl标本和90μl预混反应试剂
 
　　（3）加入80-100μl石蜡油在台式离心机上快速离心数秒钟使各反应试剂收集于油层下目前PCR试剂已商品化反应体积为25μl使用时只加入标本DNA即可
 
　　（4）将反应管置PCR扩增仪上循环参数为95℃ 30s55℃ 40s72℃ 50s循环35次最后72℃延伸5min
 
　　4．每次试验应设阳性及阴性对照以载有HPV的重组质粒（每反应为100pg）或含有HPV的细胞系（如CaskiHeLa）DNA为阳性对照以无HPV的人细胞系DNA为阴性对照
　　
　　（三）扩增产物的检测和分析
 
　　1．  凝胶电泳：扩增反应结束后取出反应管冷却至室温取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳溴化乙锭染色紫外分析仪下分析结果分子量约为450bp处出现明显的DNA带
 
　　2．  核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交斑点杂交验证
 
　　按照标准方法制32P ATP标记的寡核苷酸探针需达到约107cpm/pmol特异活性杂交液中需含有2×106-5×106cpm探针/ml在55℃缓慢振荡下杂交2-3h随后于30-55℃下用洗涤液（2×SSC0.1%SDS）迅速冲洗杂交膜除去多余探针然后进行洗膜其条件依所用探针而异：公用混合探针55℃洗膜10min；MY12MY13及MY16探针56-57℃下10 min并换液重洗1次；MY14及WD74探针58-59℃下10min亦换液重洗1次
　　
　　用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越其敏感性高GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果可检出标本中200个拷贝的HPV DNA若以核酸杂交检测PCR产物敏感性提高能检出10个拷贝的HPV DNA

　　鉴于PCR技术的高度敏感性以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求避免了活检取材研磨组织繁杂操作一般情况下PCR扩增产物经凝胶电泳观察产生的DNA可直接作出诊断因此PCR技术检测HPV实验周期短简便快速